細菌のペニシリン結合タンパク質に結合し、ペプチドグリカン架橋反応を阻害する。細胞壁合成が停止すると浸透圧に耐えられなくなり、増殖中の細菌が溶菌する。殺菌作用は有効濃度を上回る時間に依存し、主にGram陽性球菌、梅毒トレポネーマ、髄膜炎菌などへ作用する。βラクタマーゼ産生菌やペニシリン結合タンパク質が変化した菌には無効となり得る。

梅毒では病期に応じたペニシリンG製剤が標準治療となり、妊娠中の梅毒でも胎児感染予防のため中心的な薬剤である。感受性のあるA群溶血性レンサ球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、口腔内連鎖球菌、Clostridium属などによる感染症にも用いられる。神経梅毒や細菌性髄膜炎では中枢神経系へ十分到達する静注製剤を選択する。

発疹、蕁麻疹、発熱、好酸球増多、下痢などがみられ、重篤例ではアナフィラキシーを起こす。高用量投与や腎機能低下では意識障害、ミオクローヌス、痙攣などの神経毒性が生じ得る。梅毒治療開始後には菌体成分放出により発熱、悪寒、頭痛、筋肉痛が出現するJarisch-Herxheimer反応が起こることがある。

プロベネシドは尿細管分泌を阻害してペニシリンGの血中濃度を上昇させる。メトトレキサートの腎排泄を競合的に低下させ、血液毒性などを増強する可能性がある。静菌的抗菌薬との併用では、増殖中細菌に対する殺菌作用が理論上低下する場合がある。